在进行比色和分光光度测定时,首先要利用显色反应将待测组分转变为有色物质,然后再进行测定。因此,选择合适的显色反应和严格控制反应条件非常重要。

  1、显色反应的选择     显色反应分两大类,一类是配合反应,另一类是氧化还原反应。其中配合反应是主要的。测定中,待测组分能与多种显色剂进行不同的显色反应生成不同的有色物质,选择显色剂和显色反应应满足如下要求:

  (1)、灵敏度高。

  (2)、选择性好。选择干扰较少或易于除去干扰的反应。

  (3)、反应生成的有色化合物组成稳定,化学性质稳定。

  (4)、显色剂在测定波长处无明显吸收。

  显色剂分无机显色剂和有机显色剂。一般无机显色剂与待测物质的显色反应,很难满足以上条件,因而除硫氰酸盐、钼酸铵及过氧化氢少数几种外,目前应用的不多。有机显色剂以配合剂为多,显色反应多为配合反应。反应的选择性和灵敏度都较无机显色反应高,因而它广泛应用于吸光光度法中。正是由于有机显色剂的研制和应用,推动了吸光光度法的应用和发展。有机显色剂的种类繁多,常用的如双硫腙、邻二氮杂菲、丁二酮肟、二乙氨基二硫代甲酸盐等。
  
       2、测定条件的选择

  为了使比色及分光光度法有较高的灵敏度和准确度,应注意适当的光度测量条件,主要应考虑一下几点:

  (1)、入射光波长的选择 如前所述,为了使测定结果有较高的灵敏度,一般情况下,入射光波长应选择待测溶液有最大吸收的波长。但是,当有干扰物质存在时,若干扰物质在该波长处有强烈的吸收,则必须另一灵敏度稍低但能消除干扰的波长作为入射光。

  (2)、控制适当的吸光度范围 从仪器测量误差考虑,为了使测定结果有较高的准确度,一般应控制吸光度0.2-0.7,为此应控制标准溶液和待测溶液的浓度,并选择适当厚度的比色皿。

  (3)、选择适当的参比溶液 参比溶液也称为空白溶液。在光度测量中,除利用参比溶液调节仪器的零点以为,还可消除比色皿器壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差。因此参比溶液的作用是非常重要的。

  参比溶液的选择应按不同情况分别对待。当试液及显色剂均无色时,可用蒸馏水作为参比液;如果显色剂无色,而被测试液中存在其他有色离子,可采用不加显色剂的被测试液作为参比液;如果显色剂和试液均有颜色,可在一份试液中加入适量的掩蔽剂,将被测组分掩蔽起来,使之不再与显色剂作用。显色剂与其他试剂均按试液测定方法加入,以此作为参比液,这样可以消除显色剂及一些共存离子的干扰。总之,选择参比液的原则是,使试液的吸光度真正反映待测物质的浓度。